勞工安全衛生研究所衛生組
張靜文研究員、于台珊助理研究員
在生物實驗室的各項防護設施中，為避免生物性樣本、化學試劑等物質外逸造成人員健康上危害或為確保操作試驗物的潔淨，生物安全櫃可說是進行生物性相關試驗不可或缺的基礎工具，除使用上極為普遍外，更由於其選擇與使用的正確性與實驗室人員安全息息相關，因此成為使用者極為重要的課題，以下我們茲就國際上生物安全櫃的種類分級、與不同安全等級實驗室的使用搭配以及其操作上應注意的安全通則做一簡介：
提到生物安全櫃的種類與選擇，首先必須考量其防護層級應符合使用場所的生物安全等級(Biological Safety Level, BSL)，再者，則需考慮作業流程的需求及場地空間等工程上限制以挑選合適的安全櫃類型。歐美幾大先進國家在生物安全等級分類上各有相關規範，雖然若干定義上稍有不同，但對於危害等級分類的範疇卻十分接近，國內現行的規範主要依循國科會制定的「基因重組實驗守則」，其內容是參考美國國家衛生院（NIH）於1997年出版的「DNA分子重組研究指引（NIH Guidelines For Research Involving Recombinant DNA Molecules）」，將實驗規模20公升以下的培養分為P1至P4四級，20公升以上的則分為LS-C、LS-1、LS-2三級，然而其適用範圍僅限於基因重組實驗。
除基因重組實驗的規範外，美國國家衛生院於1993年亦與疾病管制中心（CDC）聯合針對微生物及其實驗室訂出生物安全等級的分類，針對各病原體對人體、環境的危害程度分為四大類，詳細分類內容可參考其出版之「微生物學級生醫實驗室生物安全（Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, BMBL）」一書，茲以此為例整理生物安全等級分類及操作準則如下：
(1) 生物安全第一類：生物病媒不會引致健康成人、動物產生疾病或者環境危險。 實驗室無須與建築物中的一般區域隔離，一般不需特殊防護的設備及設施，但工作人員仍應接受實驗操作的特別訓練。
(2)生物安全第二類：生物病媒可能會引致健康作業員、動物產生疾病或環境之中度風險。工作人員需受過使用致病物質的特殊訓練並由適任的專家指導，同時工作進行中應有門禁管制；需特別小心受污染的尖銳物品，可能產生氣膠或濺灑的操作程序，應使用生物安全櫃或各式物理性防護設備。
(3) 生物安全第三類：生物病媒可能產生健康成人致死的嚴重危險，並為氣膠傳播。實驗室須特殊設計與建造，同時工作人員應接受處理致病性及致命物質特別訓練，且由具備相當經驗且適任的科學家監督管理。處理感染性物質的過程需在生物安全櫃中進行，或使用其它物理性防範裝置，或工作人員穿配恰當保護性衣著與裝置。
(4) 生物安全第四類：生物病媒可能產生健康成人致死的嚴重危險，並且其傳播的方式與醫療的方法仍無法獲得。實驗室設於不同棟或同棟建築內的管制區域，嚴格管制實驗室門禁並完全與其他區域隔離，工作人員則必須接受處理極度危險的感染性物質的特別訓練，充分了解標準及特殊操作、設備、實驗室的防護功能，並由具備相當經驗且適任的科學家監督管理。在此級設施中的工作區，所有活動皆限於第三級生物安全櫃中；或於第二級生物安全櫃中，工作人員穿著連身式具支持生命系統通風設備的正壓工作服。
然在實驗操作上，除了依據病源體本身的生物種類分級外，亦需同時考慮其操作方式與數量，以SARS-CoV為例（如下表1所示，整理自國科會「基因重組實驗守則」），不同的操作方式與操作數量即直接影響設備、實驗室及操作規範對應的生物安全等級。
表1 操作SARS-CoV（Risk Group 3）所需之生物安全等級
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操作方式 |
設備與實驗室設計 |
操作規範 |
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血液/尿液樣本 |
BSL 2 ( P2 ) |
BSL 2(P2) |
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非血非尿樣本 |
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核酸萃取 |
BSL 2 ( P2 ) |
BSL 3(P3) |
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核酸分子分析 |
BSL 2 ( P2 ) |
BSL 2(P2) |
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細胞培養 |
BSL 3 ( P3 ) |
BSL 3(P3) |
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動物病毒接種 |
BSL 3 ( P3 ) |
BSL 3(P3) |
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總量>20 ml或總 病毒數>1.0E+09 |
BSL 4 ( P4 ) |
BSL 4(P4) |
備註：關於病原體的生物種類分級，我國國科會制定之「基因重組實驗守則」亦有列表規範，可供參考。
在瞭解了安全櫃欲擺置使用場所的生物安全分級後，接著就是依操作需求及場地限制選擇合適類型的生物安全櫃。在「微生物學級生醫實驗室生物安全」一書中，將各式安全櫃依適用的生物危害層級分為三級，其中第二級的生物安全櫃依美國2002年最新修正的第二級生物安全櫃標準NSF /ANSI 49又分為A1、A2、B1、B2四種型式。應注意的是，各式安全櫃用以保證排氣乾淨的HEPA FILTER雖可以有效的阻止粒狀物，例如具感染性的病原媒介等，但無法阻止易揮發性的化學品或有機氣體，因此若操作物含易揮發性的有毒化學品時，應有適當的排氣系統將氣體排出至外界。
第一級安全櫃結構設計如圖1 所示，其使用目的在於保護人員及環境，但並不提供對櫃內操作物種（實驗試料、產品等）的潔淨保護。
櫃體在排氣口處設有HEPA FILTER，以避免安全櫃內操作物質未經處理排出後污染環境。而在操作人員保護方面，生物安全櫃主要是藉櫃體內的氣體流場來進行操作物與人員的隔離，因此在操作區需保持最小的送風速度至少應達到0.38 m/sec (75 ft/min)。由於無法提供櫃內操作物種的潔淨保護，目前各生技相關產業中第一級安全櫃的使用已逐漸減少，多為被用於密閉的設備，如離心機、小型發酵機或伴隨有潛在產生大量氣膠的製程中使用。此級安全櫃依不同防護需求，可適用於生物安全第一、第二與第三級實驗室內。
A. 視窗開口(front opening)
B. 視窗(sash)
C. 排氣HEPA FILTER(exhaust HEPA filter)
D. 排氣室(exhaust Plenum)
E. 工作臺面
F. 格狀開口(grille)
圖1 第一級生物安全櫃構造圖
第二級安全櫃結構設計如圖2至圖5 所示，型式分為A1、A2（原B3）、B1、B2，主要針對無菌的動物組織、細胞培殖與病毒繁殖的試驗操作，因此安全櫃需提供櫃內操作物的潔淨保護。
其防護原理是以櫃內層流配合HEPA FILTER的使用來提供一個無菌的操作環境，此級安全櫃可提供人員、環境及產品三層面的保護。安全櫃運轉時，氣流經前方開口由外界引入於操作區內，用以保護人員不受操作物逸散的污染，流入操作區的外氣隨即被風壓引導流入循環室，以不流經過試料為原則，藉以保護試料產品的安全。排氣則需通過HEPA FILTER，可以被再循環回實驗室裡（型式A的安全櫃）或被排出至建築物外（型式B的安全櫃）。而後，流經HEPA FILTER到操作區的氣體流場需提供試料保護、隔離外氣及排出氣膠的功能，以將安全櫃工作臺面的交叉污染減到最低。此級安全櫃依不同防護需求，可適用於生物安全第一、第二與第三級實驗室內。
又分為A1及A2兩種，結構設計如圖2及3 所示。兩者結構極為相近，不同在於A1安全櫃要求風機在安全櫃所應提供於視窗開口氣流速度最小量或量測平均量應至少0.38 m/sec(75fpm)，而A2安全櫃要求則為0.5m/sec，且A1由於風機位置置於櫃體下方，造成櫃內通道皆處於正壓型態，若櫃體構造有所破損時，極容易造成洩漏而污染實驗室環境。型式A安全櫃氣體的循環比一般為30%經排氣口HEPA FILTER排除、70%通過回風HEPA FILTER再循環回到工作區，大部分此類型安全櫃設有調節閥，可以調整30%與70%的氣流分配。
另外應注意的是，無裝設排氣導管的A型式安全櫃不可使用在易揮發性或有毒化學物質的實驗上，若排氣有污染環境之虞時，應使用可拆卸式的套管環繞氣罩部分，將排氣排出建築物外，且排氣流量必須足夠維持安全櫃操作面進氣與HEPA排氣間的氣體流動。
B. 視窗
C. 排氣HEPA FILTER
D. 供氣HEPA FILTER(Supply HEPA filter)
E. 後氣室(Rear plenum)
F. 風機
圖2 第二級A1型生物安全櫃構造圖
A. 視窗開口
B. 視窗
C. 排氣HEPA FILTER
D. 供風HEPA FILTER
E. 正壓氣室(Positive pressure plenum)
F. 負壓氣室(Negative pressure plenum)
圖3 第二級A2（原B3）型生物安全櫃構造圖
又分為B1、B2兩種，結構設計分別如圖4、5及圖6 所示。此類型第二級安全櫃發源自國際癌症學會(National Cancer Institute)，其被設計用來進行玻璃試管內的操作微量危險化學品，與型式A安全櫃最為不同的地方在於其一定直接或接管於室外排氣，同時回風比例亦較形式A低，即大部分使用後氣流不再過濾循環使用，甚至B2為完全無循環氣體使用。一些生物醫療的研究需要使用到小量危險的化學製品，如致癌化學蒸汽等，這些物質應當被操作在穩定的氣流區間（如層流空間）以隔離人員，並在操作區的排氣導管中連結氣罩並過濾至建物排氣系統中釋放。
B1型式的安全櫃具有附加的HEPA FILTER以消除由操作區產生的微粒與化學物質對下游風機的污染。操作區的下吹氣流至少需達0.5 m/sec或以上，氣流到工作檯面分離後應有70%的氣體流入後方格狀開口的設計條件，其餘30%的氣體(含外氣流入部分)進入前方格狀開口的回風室中。該型式安全櫃必須連結排氣導管，最好有與空調排氣系統分離的專屬的排氣系統，建議建物的排氣系統中具備獨立的壓力監視器，在排氣端應裝設失效警鈴，並由安全互鎖裝置連接安全櫃以切斷供風扇電力。其結構設計上另有Bench Top型，就是設計將風機安裝於安全櫃上方(圖5 )，同樣可提供與基本型相同的保護。
型式B2的安全櫃為100%排氣，無再循環使用，供氣需達操作區的下吹氣流至少0.5 m/sec以上，當試驗中使用的化學藥品會侵蝕HEPA濾材、框架等物件時，可考慮使用此類型以減少迴風濾材上的消耗。
A. 視窗開口
B. 視窗
C. 排氣HEPA FILTER
D. 供風HEPA FILTER
E. 負壓排氣室(Negative pressure exhaust plenum)
F. 風機
G. 附加排氣HEPA FILTER(Additional HEPA filter for supply air)
圖4 第二級B1型生物安全櫃構造圖（基本型，本型安全櫃的排氣需連接至建築物的排氣系統）
A. 視窗開口
B. 視窗
C. 排氣HEPA FILTER
D. 負壓排氣室
E. 供風HEPA FILTER
F. 風機
G. 供風室(Supply plenum)
圖5 第二級B1型生物安全櫃構造圖（Bench Top型設計，本型安全櫃的排氣需連接至建築物的排氣系統）
A. 視窗開口
B. 視窗
C. 排氣HEPA FILTER
D. 供風HEPA FILTER
E. 負壓排氣室
F. 風機
G. 供風分佈口(Supply Diffuser)
Note: 建築物的排氣系統及活性碳過濾器不列於本圖上。
圖6 第二級B2型生物安全櫃構造圖（本型安全櫃的排氣需連接至建築物的排氣系統）
第三級的生物安全櫃結構設計如圖7 所示，其使用時機在於操作被歸類於生物安全第四級的微生物試劑，通常安裝於已經管制出入、特殊通風或特殊防護系統的最嚴格污染控制實驗室內。
安全櫃的內部需為一個漏氣率低於10-5ml/sec的封閉空間，並含一個封閉的觀察視窗，對於試料在此封閉的安全櫃是採取通過一浸水槽（可穿過安全櫃臺面）或雙層門的開口箱（如一雙門滅菌鍋）方式進出。此型式安全櫃的供給與排出氣體均需經過HEPA FILTER過濾。對外排氣時，氣壓應受安全櫃外部的專用獨立排氣系統所控制，以保持安全櫃任何時刻均在負壓狀態下，負壓值通常約為0.124 kPa。此類型安全櫃的實驗操作為利用附加於安全櫃窗口的密封橡膠手套進行，以避免使用者直接接觸危險的物質。
B. 視窗
C. 排氣HEPA FILTER
D. 供風HEPA FILTER
E. 兩頭型滅菌鍋或傳遞箱(Double ended autoclave or pass-through box)
Note: 在安全櫃中化學浸泡槽應被裝置在工作臺面之下。
圖7 第三級生物安全櫃構造圖（本型安全櫃的排氣需連接至建築物的排氣系統）
生物物安全櫃對人員、環境與操作物所提供的保護依其等級不同而有所差異，表2為上述三種等級安全櫃之特性列表整理，包括了最為基本的操作面速度要求、適用物質型態等，而表3則為使用場所的生物安全等級與應選用安全櫃等級的對照表，可供使用者作一快速比對參考。
表2 各型式生物安全櫃的特性比較
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安全櫃等級 |
操作面 風速 （m/sec） |
空氣流動型態 |
適用型態 |
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|
非揮發性有毒化學品及放射性物質 |
揮發性有毒化學品及放射性物質 |
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I |
0.38 |
排氣經由HEPA FILTER連結排氣系統到建物外面或經由HEPA FILTER進入房間 |
可 |
可 |
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II, A1 |
0.38 |
70%經過HEPA再循環至工作區 30%利用平衡閥經由HEPA經由導管排至外界 |
可 （微量） |
否 |
|
II, A2 （B3） |
0.50 |
循環機制同A1 排氣管路與氣室、循環管道需設計為負壓 |
可 |
可 （微量） |
|
II, B1 |
0.50 |
30%經過HEPA再循環至工作區 70%利用平衡閥經由HEPA經由導管排至外界 安全櫃之排氣需經由專用導管排放至外界且必須通過HEPA FILTER |
可 |
可 （微量） |
|
II, B2 |
0.50 |
無循環氣流，所有排到外界的氣體需通過HEPA FILTER |
可 |
可 （小量） |
|
III |
N/A |
排氣口處需經兩個過濾器處理 |
可 |
可 （小量） |
表3 生物安全櫃等級的選擇
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實驗室 生物安全等級 (Biological safety Level, BSL) |
應選用的 安全櫃等級 |
所能提供的保護 |
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人員 |
試品 |
環境 |
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1 ~ 3 |
I |
可 |
否 |
可 |
|
1 ~ 3 |
II （A1,A2 B1,B2） |
可 |
可 |
可 |
|
4 |
III |
可 |
可 |
可 |
在於安全櫃工作之前，應事先準備一份物料需求清單，並將所需要的物料儘可能的先置於安全櫃內，以使在安全櫃內的手部移動次數能減到最小，且為避免因為手臂移動破壞櫃內脆弱的空氣屏障，減弱安全櫃之保護性能，移動時動作不宜過快，方向儘可能垂直於開啟門的表面。
開始工作之前應先以70%酒精擦拭操作檯，同時於操作前開啟安全櫃內的抽氣機至少3至5分鐘以淨化安全櫃內殘留氣膠或微粒，操作人員應穿著實驗衣並配戴橡膠手套以保護手部，手套必須戴超過實驗外衣的袖口，調整坐椅高度至臉部高於安全櫃前端對外開口。
為避免放置於安全櫃內的器具或試料造成櫃內氣流的干擾而引起防護氣流的失效及交叉污染效果，因此多餘的用品應置於櫃外，櫃內只應有工作期間所需要的物品。此外，物品擺置應盡可能於操作檯面後半段，且須遠離兩端的格狀開口，容易產生氣膠的藥品或設備（如混合器、離心機等）應置於臺面的最遠端，試驗樣本等擺放則主要以使供氣氣流由低污染流向高污染試料區為原則。
所有操作必須在前方格狀開口後緣至少10公分處進行，具有潛在危害的物質應事先經過消毒處理程序或密封後無外洩之虞後才能移出櫃外，安全櫃操作者應受過安全訓練或具有良好微生物處理技術與經驗，以降低操作者暴露於傳染性疾病樣本的潛在危險。
操作試驗時，打開的管子或瓶子勿以垂直的方式握住，研究人員進行組織培養皿有關的工作時應握取無菌面上方的蓋子以減少向下氣流的直接衝擊，打開的容器應儘速在將其關閉，以減少交叉感染的機會。
在安全櫃應儘能避免進行物質燃燒的操作，因火焰會產生自然對流使層流受嚴重干擾而造成污染的擴散，因此如種菌時接種環滅菌等需火源動作，可考慮以一種接觸平面式(touch-plate)的微燃燒器取代。
受污染的物料以櫃中預置的生物污染防治袋收集後密封，再移置滅菌設備殺菌後丟棄，生物櫃操作臺面、櫃體內壁及視窗內部玻璃則以70%濃度的酒精或是用1:100稀釋的家用的漂白劑加以擦拭，或是使用針對某些特別試驗操作所使用的其他消毒劑清潔之，當使用漂白劑時，最好再以無菌水（sterile water）進行次清潔擦拭，以避免殘留下來的氯造成不銹鋼表面腐蝕。
若試驗中不慎污染了安全櫃前後的格狀開口，則整個清潔工作必須包括櫃內所有物品及安全櫃內部，而在執行傳染性病菌的試驗工作後，更換HEPA FILTER或進行內部維修工作前則必須先進行HEPA FILTER的清潔工作，最常使用的方法為使用甲醛（formaldehyde）進行整個櫃體的燻蒸殺菌。
A.排氣系統等週遭設施
在生物安全第三級與第四級的實驗室中，生物安全櫃廢氣的排放必須直接以獨立導管輸出經過濾後排放至建築物外，排出的氣體須經HEPA FILTER過濾，這些裝置及過程在四級實驗室是絕對必要的，但在三級實驗室則有可選擇性。另外，當安全櫃的排氣室靜壓發生改變時，建築物排氣系統的設計在進行氣體排除時亦須有足夠能力去處理所有的排放氣體，若建物排氣系統無法達成此一要求時，則每一個安全櫃必須有專用的獨立排氣系統。雖然生物安全櫃被認為是處理具傳染性物質的主要安全屏障。但是實驗室本身應具有其它次級屏障的防護措施，例如藉由實驗室負壓以建立室內的向內流動氣流，實驗室內空氣由緊鄰的空間或前室提供等等，這些需求在生物安全第二級的實驗室中為可選擇性的，但是在第三級實驗室中則為必要，所有設備的氣流平衡必須達成來確保氣流從污染最小的區域到污染最大的區域。
而安全櫃內的電力系統必須連接地線且為獨立供應之電源，所有非電力的公用設施最好裝置在櫃體外部，並設有易於操作的關閉閥門。當櫃內試驗需使用易燃性氣體時，為防止火災發生，櫃體外側應設有緊急使用的氣體關閉閥，而在操作生物危險性較高的試驗，應儘可能避免於安全櫃內使用壓縮空氣系統，以避免高壓容器失效而引起危害氣膠散逸的潛在危機。
若安全櫃有使用紫外線(ultraviolet, UV)燈具，每週應進行清潔以防止因為灰塵或污染物的累積而降低了殺菌功能，亦應定期量測其UV光線的強度以確保其殺菌效果，UV燈具開啟作用時，人員應避免於櫃體開口面區域活動，以保護人員眼睛及皮膚健康。
B.生物安全櫃設置位置
建議安全櫃周邊的前後左右都能預留足夠的空間以利該設施進行操作及維護。安全櫃的擺放應確保實驗室的循環氣體不至於受安全櫃位置而阻礙其流動，理想的擺放位置必須遠離房間出入口及走道，因為人員的走動與安全櫃的進氣面平行將使櫃內的氣流屏障受嚴重干擾，且櫃體上方最好預留30至40公分的空間，以利排氣系統的HEPA過濾器更換。
而由於在操作檯面前所形成的氣流屏障相當脆弱，在打開窗口，空調或實驗室設備時皆會引起空氣的擾動，故應安全櫃擺設位置亦應與排氣櫃、空調風口、冷氣機出風口等保持適當距離。
C.安全櫃HEPA過濾器的維護
在平時使用甲醛氣體進行櫃內燻蒸滅菌時，排氣系統包含HEPA過濾器應在過濾器的進氣口處裝設不透氣的調節閘，以保護在進行消毒工作時過濾器材料不受污染。
當HEPA過濾器因微粒負載造成壓損過大以致無法繼續使用須進行更換時，需注意在更換過濾器之前必須進行消毒滅菌的工作，以保護維修人員避免遭HEPA過濾器上的微生物體污染。目前有種袋式 （bag-in/ bag-out, BIBO）過濾器可完全有效隔離人員於維護時與HEPA過濾器的接觸，其組裝如下圖8所示，適合於當HEPA過濾器所處理氣體具生物危害、危險性物質或有毒性化學物質時使用。
備註：BIBO系統必須在購買安全櫃時就需確認其具有該項功能，不能在事後才加裝於安全櫃中。
A. 過濾器
B. 袋子
C. 安全環
D. 中束環
E. 密縫線為於PVC袋的開口，使袋子環繞於支持物的外罩邊緣
圖8 袋式HEPA過濾器